一、活性氧檢測

自由基(free radicals)，是指帶不成對電子的原子、分子、離子或原子團(tuán)。自由基的種類很多，如以氧(O)、碳(C)、氮(N)為中心的活性基團(tuán)?；钚匝踝?reactive oxygen species, ROS)是生物體內(nèi)一些氧化反應(yīng)中形成的氧自由基，常見有超氧化陰離子(O2－)，過氧化氫(H2O2)，過氧化自由基(ROO－)和氫氧自由基(OH－)等形式。自由基外層具有非配對電子，其化學(xué)性質(zhì)非常活潑，它既是電子供體，又是電子受體。

活性氧是細(xì)胞線粒體氧化呼吸中產(chǎn)生的自由基活性的物質(zhì)，參與細(xì)胞多種生理和病理形成機(jī)制。檢測細(xì)胞ROS的含量，可以了解ROS在細(xì)胞一些生理和病理狀態(tài)中的變化，分析藥物效應(yīng)和相關(guān)機(jī)制。

活性氧檢測試劑盒是利用ROS熒光探針－DCFH-DA進(jìn)行活性氧檢測的試劑盒。DCFH-DA本身沒有熒光，可自由透過活細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使探針很容易被裝載到細(xì)胞內(nèi)。細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無熒光的DCFH生成有熒光的DCF。檢測DCF的熒光就可以知道細(xì)胞內(nèi)的活性氧水平。根據(jù)活細(xì)胞中紅色熒光的產(chǎn)生，可以判斷細(xì)胞ROS含量的多少和變化。本試劑盒本底低，靈敏度高，線性范圍寬，使用方便。

二、TUNEL

TUNEL(TdT-mediated DUTP nick end labeling)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測組織細(xì)胞在凋亡早期過程中細(xì)胞核DNA的斷裂情況。其原理是熒光素（fluorescein）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3’-OH末端，并與連接辣根過氧化物酶（HRP，horse-radish peroxidase）的熒光素抗體特異性結(jié)合，后者又與HRP第五二氨基聯(lián)苯胺（DAB）反應(yīng)產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在光學(xué)顯微鏡下即可觀察凋亡細(xì)胞。由于正常的或正在增值的細(xì)胞幾乎沒有DNA斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒適用于組織樣本（石蠟包埋、冰凍和超薄切片）和細(xì)胞樣本（細(xì)胞涂片）在單細(xì)胞水平上的凋亡原位檢測。

三、Annexin/PI染色

凋亡和壞死，是常見的細(xì)胞死亡的兩種方式，它們有著截然不同的特征。凋亡是細(xì)胞程序性死亡的主要表現(xiàn)形式，是一個(gè)主動(dòng)性的生理反應(yīng)機(jī)制；壞死則是細(xì)胞對嚴(yán)重?fù)p傷的一種被動(dòng)反應(yīng)和變性過程。

凋亡涉及一系列復(fù)雜的生理生化反應(yīng)，終導(dǎo)致細(xì)胞的解體。凋亡細(xì)胞的許多改變是特征性的。

細(xì)胞與胞核固縮是凋亡早期發(fā)生的形態(tài)學(xué)變化，這些改變與細(xì)胞骨架的特異性解體有關(guān)。核固縮伴隨的染色體固縮，有顯著的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)。碎裂的核片斷可以被胞膜包裹游離出細(xì)胞外，成為凋亡小體，并被周圍細(xì)胞吞噬。染色質(zhì)的這些特征性變化，可以用顯微鏡直接觀察，或用一些熒光染料染色，在熒光顯微鏡下觀察或進(jìn)行流式細(xì)胞分析。

Annexin是一類廣泛分布于真核細(xì)胞細(xì)胞漿內(nèi)鈣離子依賴的磷酯結(jié)合蛋白，參與細(xì)胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。但僅Annexin V被報(bào)道可以調(diào)控一些PKC的活性。

Annexin V選擇性結(jié)合磷酯酰絲氨酸(phosphatidylserine，簡稱PS)。磷酯酰絲氨酸主要分布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，即與細(xì)胞漿相鄰的一側(cè)。在細(xì)胞發(fā)生凋亡的早期，不同類型的細(xì)胞都會把磷酯酰絲氨酸外翻到細(xì)胞表面，即細(xì)胞膜外側(cè)。磷酯酰絲氨酸暴露到細(xì)胞表面后會促進(jìn)凝血和炎癥反應(yīng)。而Annexin V和外翻到細(xì)胞表面的磷酯酰絲氨酸結(jié)合后可以阻斷磷酯酰絲氨酸的促凝血和促炎癥反應(yīng)活性。用帶有綠色熒光的熒光探針FITC標(biāo)記的Annexin V，即Annexin V-FITC，就可以用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡非常簡單而直接地檢測到磷酯酰絲氨酸的外翻這一細(xì)胞凋亡的重要特征。因此Annexin V是檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)。

碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)染色液是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但可以染色壞死細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞，呈現(xiàn)紅色熒光。對于壞死細(xì)胞，由于細(xì)胞膜的完整性已經(jīng)喪失，Annexin V-FITC可以進(jìn)入到細(xì)胞漿內(nèi)，與位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷酯酰絲氨酸結(jié)合，從而也使壞死細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光。因此將Annexin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及壞死細(xì)胞區(qū)分開來。