克隆形成實驗

簡要描述：克隆形成實驗是測定細胞增殖能力的有效方法之一，貼壁后的細胞不一定每個都能增殖和形成克隆，而形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。細胞克隆形成率表示接種細胞后貼壁的細胞成活并形成克隆的數(shù)量，可以反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀。

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詳細介紹

實驗步驟

1.取對數(shù)生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，并把細胞懸浮在10%胎牛血清的細胞生長培養(yǎng)基中備用。

2.將細胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組細胞每皿分別接種100個細胞于含10ml 37℃預溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動，使細胞分散均勻。

3.置37℃ 5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。

4.當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5.加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。

6.去固定液，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘

7.用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

8.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)。后計算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細胞數(shù)）×100%

9.平板克隆形成試驗方法簡單，適用于貼壁生長的細胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。試驗成功的關鍵是細胞懸液的制備和接種密度。細胞一定要分散得好，不能有細胞團，接種密度不能過大。

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